Jurnal Actinomycetes

Deteksi Produksi Oxytetracycline oleh Streptomyces rimosus mikrokosmos dengan menggabungkan Whole Biosensor dan Cytometry Arus (Detection of Oxytetracycline Production by Streptomyces rimosus in Soil Microcosms by Combining Whole-Cell Biosensors and Flow Cytometry) Penulis1 (Muslimatin) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember (UNEJ) Jln. Kalimantan 37, Jember 68121 E-mail: DPUHYPERLINK "mailto:DPU@unej.ac.id"@unej.ac.id Abstrak Menggabungkan kekhususan tinggi biosensor bakteri dan kekuatan resolusi fluoresensi-diaktifkan sortasi sel (FACS) disediakan deteksi kualitatif produksi oxytetracycline byStreptomyces rimosus di mikrokosmos tanah. Sebuah plasmid yang mengandung perpaduan antara transkripsi thetetR-diatur promotor Ptet dari Tn10 dan FACS-dioptimalkan gen gfp dibangun. Ketika memendam oleh Escherichia coli, ini plasmid menghasilkan sejumlah besar protein fluorescent hijau (GFP) di hadapan tetracycline. Ini biosensor tetrasiklin digunakan untuk mendeteksi produksi oxytetracycline oleh S. Rimosus introduced ke dalam tanah steril. Tetrasiklin-induced GFP-memproduksi biosensor yang terdeteksi oleh analisis FACS, memungkinkan deteksi pertemuan oxytetracycline oleh sel biosensor tunggal. Pendekatan ini dapat digunakan untuk mempelajari interaksi antara produsen antibiotik dan mereka target organisme dalam tanah. Kata kunci : Streptomyces rimosus, FACS, biosensor, GFP Abstract Combining the high specificity of bacterial biosensors and the resolution power of fluorescence-activated cell sorting (FACS) provided qualitative detection of oxytetracycline production byStreptomyces rimosus in soil microcosms. A plasmid containing a fusion between the promoter-regulated transcription thetetR Ptet of Tn10 and FACS-optimized gfp gene constructed. When harbored by Escherichia coli, this plasmid produces large amounts of green fluorescent protein (GFP) in the presence of tetracycline. This tetracycline biosensor used to detect the production of oxytetracycline by S. Rimosus Introduced into sterile soil. Tetracycline-induced GFP-producing biosensors were detected by FACS analysis, enabling detection of oxytetracycline meeting by single biosensor cells. This approach can be used to study the interaction between antibiotic producers and their target organisms in the soil. Keywords: Streptomyces rimosus, FACS, biosensor, GFP Pendahuluan Penggunaan biosensor bakteri, yaitu, bakteri memberikan respon dengan mudah diukur setelah terpapar senyawa tertentu atau kondisi lingkungan, adalah pendekatan baru yang menjanjikan dalam biologi lingkungan. Penggunaannya telah Namun, sampai sekarang terbatas pada pengukuran dalam sampel lebih homogen seperti air curah dan ekstrak tanah. Tanah adalah matriks kompleks microhabitats berunding kondisi pertumbuhan sangat bervariasi untuk mikrobiota. Kemampuan untuk memperoleh pemahaman tentang ekologi mikroba tanah dan proses mikroba telah sangat terhambat oleh ketidakmampuan untuk mengkarakterisasi ini microhabitats pada skala atau resolusi yang relevan dengan sel mikroba. Karena spesifisitas tinggi, sensitivitas, dan skala yang tepat, keseluruhan sel biosensor menawarkan pendekatan yang bisa menangani masalah ini dari resolusi spasial. Tinjauan Pustaka Streptomyces adalah bakteri gram positif yang menghasilkan spora yang dapat ditemukan di tanah. Bakteri ini nonmotil dan berfilamen, Selain ditemukan pada tanah, bakteri ini juga dapat ditemukan pada tumbuhan yang membusuk. Streptomyces dikenal juga karena memproduksi senyawa volatil yaitu Geosmin yang memiliki bau khas pada tanah. Streptomyces termasuk ke dalam golongan Actinomyces yaitu bakteri yang memiliki struktur hifa bercabang menyerupai fungi dan dapat menghasilkan spora. Karakteristik Streptomyces Karateristik Streptomyces yang lain adalah koloni mereka yang keras, berbulu dan tidak/jarang berpigmen. Streptomyces adalah organisme kemoheteroorganotrof yaitu organisme yang mampu menggunakan materi organik yang kompleks sebagai sumber karbon dan energi. Materi yang mereka dapatkan berasal dari degradasi molekul ini di dalam tanah. Karena sifat ini bakteri ini penting untuk menjaga tekstur dan kesuburan tanah, Bakteri ini memiliki suhu optimal untuk pertumbuhan pada 25oC dan pH 8-9. Streptomyces jarang bersifat patogen, tetapi beberapa spesies seperti S. somaliensis dan S. sudanensis dapat menyebabkan mycetoma serta dapat menyebabkan penyakit scabies pada tanaman disebabkan oleh S. caviscabies dan S. Scabies. Manfaat Streptomyces Diketahui pula bahwa Streptomyces adalah sumber utama senyawa antibiotik dewasa ini. Saat ini, Streptomyces memproduksi lebih dari dua pertiga antibiotik alami yang berguna secara klinis. Streptomycin adalah salah satu contoh antibiotik terkenal yang berasal dari Streptomyces, Antibiotik primer tersebut dapat diaplikasikan pada manusia (sebagai obat antikanker, immunoregulator) atau digunakan sebagai herbisida, agen anti-parasit, dan penghasil beberapa enzim penting untuk industri makanan dan industri lainnya. Streptomyces dikenal karena kemampuannya untuk mensintesis senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain, antara lain Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, dan Shigella dysenteriae. Antibiotik yang dihasilkan oleh Streptomyces sangat banyak, antara lain neomisin dan kloramfenikol. Selain itu antibiotik streptomisin juga dinamakan berdasarkan bakteri penghasilnya, yaitu Streptomyces griseus. Antibiotik yang dihasilkan oleh genus ini antara lain nystatin dari S. noursei, amphotericin B dari S. nodosus, natamycin dari S. natalensis, erythromycin dari S. erythreus, neomycin dari S. fradiae, streptomycin dari S. griseus, tetrasiklin dari S. rimosus, vancomycin dari S. orientalis, rifamycin dari S. mediterranei, chloramphenicol dari S. venezuelae, puromycin dari S. alboniger dan lincomycin dari S. lincolnensis. Keuntungan utama menggunakan bakteri biosensor untuk mendeteksi atau mengukur senyawa tertentu dalam sampel alam adalah bahwa hanya fraksi tersedia untuk bakteri, fraksi bioavailable, terdeteksi. Oleh karena itu, pengukuran yang dilakukan relevan dengan efek senyawa pada masyarakat mikroba. Sebuah aplikasi menarik dari biosensor bakteri adalah deteksi antibiotik bioavailable dalam lingkungan yang berbeda. Deteksi antibiotik yang dihasilkan dari produksi antropogenik atau alami sangat penting bagi pemahaman kita tentang evolusi resistensi antibiotik. Apakah antibiotik diproduksi di tanah dengan organisme tanah adat telah menjadi sengketa ilmiah selama beberapa dekade. Kebanyakan antibiotik diekskresikan sebagai metabolit sekunder ketika produsen yang tumbuh di media yang kaya. Hal ini tidak jelas bahwa kondisi di tanah alami akan memungkinkan jenis pertumbuhan yang diperlukan untuk memproduksi dan buang antibiotik. Pertumbuhan produsen antibiotik potensial seperti streptomycetes dalam tanah diperkirakan dilokalisasi di daerah berlainan, daripada merata di seluruh tanah. Oleh karena itu, produksi dan kehadiran antibiotik kemungkinan akan terbatas pada beberapa microhabitats mana kondisi yang menguntungkan. Hal ini membuat deteksi produksi antibiotik pribumi dengan metode konvensional sulit. Streptomyces rimosus adalah produsen industri dikenal oxytetracycline dan awalnya diisolasi dari tanah. Memang, produsen mikroba yang paling dikenal dari tetrasiklin yang berbeda bakteri asli tanah. Actinomycetes biasanya hadir dalam jumlah besar di dalam tanah, dan mereka merupakan sekitar 10% dari populasi mikroba culturable, melebihi 1 juta CFU / g tanah. Selain itu, sejumlah besar faktor penentu resistensi tetrasiklin sering ditemukan pada sampel tanah. Hal ini menimbulkan spekulasi bahwa gen resistensi tetrasiklin yang hadir di tanah karena tetrasiklin yang diproduksi di sana. Namun, produksi tetrasiklin dalam tanah sebelumnya pernah ditunjukkan oleh deteksi langsung, karena kurangnya metode deteksi dengan kekhususan yang diperlukan dan kekuatan resolusi. Kebanyakan studi, bertujuan untuk menguji produksi antibiotik dalam tanah, telah mempekerjakan ekstraksi antibiotik dari tanah sebelum analisis. Namun, metode ini tidak mengambil distribusi spasial serta bioavailabilitas senyawa ke rekening. Jika antibiotik diproduksi hanya dalam jumlah kecil dalam microhabitas beberapa lokal, jumlah ini akan sangat diencerkan selama ekstraksi. Pengenceran ini benar-benar bisa menutupi kehadiran senyawa, sehingga hasil negatif palsu. Pembahasan Deteksi biosensor dari tetracycline dalam tanah dengan analisis FACS dalam penelitian ini dicapai oleh pembangunan biosensor bakteri yang mengandung gen GFP bawah peraturan Ptet promotor tetrasiklin-responsif. Sebuah tetrasiklin-induced ada GFP penghasil membangun biosensor tidak menghasilkan fluoresensi yang cukup untuk deteksi dalam penyortir FACS. The GFP dihasilkan dari konstruksi ini memiliki panjang gelombang eksitasi yang optimal dari 395 nm dibandingkan dengan FACS, yang menggairahkan menggunakan sinar laser 488 nm-. Itu sangat tidak memadai ketika sampel tanah dianalisis, karena Sturt National tanah Taman digunakan dalam penelitian ini mengandung partikel lemah neon banyak memberikan menyebarkan maju dan sinyal SSC di kawasan yang sama dengan Engkau. coli MC4100 sel. Dua biosensor baru karena itu kloning menggunakan gen FACS-dioptimalkan gfp menyatu ke tet represor gen tetR dan Ptet thetet promotor. GFP dihasilkan dari gen ini memiliki peningkatan 21 kali lipat dalam intensitas fluoresensi ketika bersemangat pada 488 nm dibandingkan dengan GFP wild type. Hal ini membuatnya lebih cocok untuk analisis FACS. Dua versi ini membangun biosensor dibuat. Plasmid pTGFP1 containstetR-Ptet, "alami" terjemahan inisiasi wilayah dari gen Teta, fusi gen gfp FACS-dioptimalkan. PTGFP2 plasmid yang terkandung, di samping komponen pTGFP1, terjemahan sangat efisien inisiasi daerah dari atpEgene E. coli. Fluoresensi yang dihasilkan dari pTGFP1 jauh lebih rendah daripada fluoresensi dari pTGFP2. Hal ini berlaku baik untuk basal-tingkat ekspresi GFP (pada 0 ug oxytetracycline per ml) dan pada konsentrasi yang lebih tinggi. E. coli MC4100 mengandung baik plasmid menunjukkan peningkatan fluoresensi dalam menanggapi konsentrasi oksitetrasiklin meningkat. Kedua budaya diinduksi dengan 50 ng per ml oxytetracycline kemudian diuji dalam penyortir FACS. Pada konsentrasi oksitetrasiklin, induksi yang jelas terlihat dalam E. coli MC4100/pTGFP2. Kedua budaya diinduksi ditambahkan ke tanah yang akan digunakan dalam percobaan mikrokosmos, diekstraksi dengan PBS, disaring, dan dijalankan melalui penyortir FACS. Hanya budaya diinduksi E. coli MC4100/pTGFP2 adalah mudah dibedakan dari partikel lain dalam tanah. Microcosms.Four set mikrokosmos tanah steril yang mengandung angka tinggi sel dari biosensor bakteri E. coli tetrasiklin MC4100/pTGFP2 didirikan. Untuk setiap set, penurunan jumlah spora S. rimosus ditambahkan. Setelah inkubasi, mikrokosmos yang dikorbankan dan isi dari bakteri biosensor induksi ditentukan oleh analisis FACS. Kesimpulan Dengan menggunakan Streptomyces rimosus dewasa ini dapat dideteksi produksi dari Oxytetracycline dengan metode – metode yang semakin hari semakin dikembangkan . Metode yang digunakan dalam artikel ini adalah Whole Biosensor yang digabungkan dengan Cytometry Arus. Ketika memendam oleh Escherichia coli, ini plasmid menghasilkan sejumlah besar protein fluorescent hijau (GFP) di hadapan tetracycline. Ini biosensor tetrasiklin digunakan untuk mendeteksi produksi oxytetracycline oleh S. Rimosus introduced ke dalam tanah steril. Pendekatan ini dapat digunakan untuk mempelajari interaksi antara produsen antibiotik dan mereka target organisme dalam tanah. Daftar Pustaka 1. Anonim, Genetics of Streptomyces rimosus, the Oxytetracycline Producer. G:\Genetics of Streptomyces rimosus, the Oxytetracycline Producer.htm. [diakses tanggal 9 maret 2013] 2. Bertrand K. P., Postle K., Wray L. V. Jr., Reznikoff W. S.(1984) Construction of a single-copy promoter vector and its use in analysis of regulation of the transposon Tn10 tetracycline resistance determinant. J. Bacteriol. 158:910–919 3. Bronstad K., Dronen K., Ovreas L., Torsvik V.(1996) Phenotypic diversity and antibiotic resistance in soil bacterial communities. J. Ind. Microbiol. 17:253–259